Hvað er CRISPR og hvernig virkar sú tækni?

Nafn þitt

Netfang þitt

Netfang móttakanda

Ruslpóstvörn =

Svar

Hvað er CRISPR og hvernig virkar sú tækni?
Þegar talað er um CRISPR nú á dögum er yfirleitt verið að vísa til byltingakenndrar aðferðar við að framkalla stökkbreytingar í erfðaefni lífvera. Byltingin felst í því að hægt er, með nákvæmum hætti, að framkalla nokkurn veginn hvaða erfðabreytingu sem við getum látið okkur detta í hug, í hvaða frumu og hvaða lífveru sem er (en hvort við ættum að gera það er svo önnur spurning). Fyrir þróun þessarar tækni fengu vísindakonurnar Emmanuelle Charpentier við Max Planck-stofnunina í Berlín og Jennifer A. Doudna við Háskólann í Kaliforníu, Berkley, Nóbelsverðlaun árið 2020.^[1]

CRISPR-kerfið er fengið að láni frá dreifkjörnungum (bakteríur og fornbakteríur eða arkeur), en það tilheyrir ónæmiskerfi þeirra og er til staðar hjá um 40% baktería og 90% fornbaktería. Bakteríur eru ekki lausar við að fá sýkingar frekar en við mannfólkið. Í stuttu máli felst ónæmisviðbragð CRISPR-kerfisins í dreifkjörnungum í því að safna sýnum úr grunsamlegu erfðaefni sem hefur komist inn í frumuna, það er erfðaefni veira eða annarra þátta sem sýkja bakteríuna, og geyma í einskonar gagnabanka í erfðamengi sínu. Það gerir ónæmiskerfinu kleift að bera kennsl á sýkilinn ef sýkingu af sömu tegund ber aftur að garði.

Þetta kerfi uppgötvaðist fyrir tilviljun seint á 9. áratugnum þegar verið var að raðgreina ótengt efnaskiptagen í bakteríunni E. coli. Rétt ofan við genið sem verið var að raðgreina fundust sérkennilegar endurtekningar sem samanstóðu af sömu samhverfu 29 DNA basaröðunum, það er þær lesast eins í báðar áttir. Þessar raðir tilheyrðu CRISPR-setti E. coli-bakteríunnar sem í heild samanstendur af tólf endurtekningum af þessari sömu 29-basa DNA röð og á milli þeirra geymir bakterían sýni úr erfðaefni sýkla sem áður hafa orðið á vegi hennar. Þetta átti þó ekki eftir að skýrast fyrr en um 20 árum síðar.^[2][3] Árið 2002 kom hugtakið CRISPR fyrst fram í grein frá Ruud Jansen og félögum hjá Háskólanum í Utrecht í Hollandi. CRISPR stendur fyrir clustered regularly interspaced short palindromic repeats, sem vísar til þessara endurteknu raða.^[4]

Í ljósi þess hve útbreitt CRISPR-kerfið er meðal dreifkjörnunga er ekki að undra að það finnist í ýmsum útfærslum. CRISPR getur verið breytilegt eftir skipulagi og lengd raða í erfðamengi, tegundum ensíma og því hvernig erfðaefni sýkilsins er klippt. Til hægðarauka verður hér sérstaklega fjallað um það kerfi sem kallast CRISPR/Cas9 og er það sem mest hefur verið notað í erfðavísindum.

Við sýkingu bakteríu er sýklaskráin, ef svo má að orði komast, umrituð í RNA-sameindir (CRISPR-RNA eða crRNA) og ef þær finna samsvörun, það er að segja að crRNA þekki erfðaefni sýkilsins af fyrri kynnum, leiðbeina þær ensíminu Cas9 að erfðaefni sýkilsins, sem klippir það. Auk þess eru tjáðar aðrar stuttar RNA-sameindir sem geta leitt saman crRNA-sameindirnar og Cas9 og kallast tracrRNA (e. trans-activating crRNA). Mikilvægt atriði í þessu kerfi og ákveðinn varnagli er að Cas9 klippir aðeins í návígi við stuttar raðir sem kallast PAM (e. protospacer adjacent motif) og eru til staðar í erfðaefni sýkilsins en ekki erfðamengi bakteríunnar. Þannig þekkir Cas9 í sundur erfðaefni sýkilsins og sitt eigið.^[5][6][7]

Emmanuelle Charpentier, fyrrnefndur Nóbelsverðlaunahafi, vann við rannsóknir á bakteríunni Streptococcus pyogenes, sem við þekkjum helst fyrir hvimleiðar strepptókokka-sýkingar. Hún sýndi fram á tilvist tracrRNA árið 2011 og síðar, í samstarfi við Jennifer Doudna, tókst þeim að finna leið til að hagnýta CRISPR/Cas9-kerfið úr S. pyogenes. Með því að hanna RNA sameindir með samsvörun við þá röð sem markmiðið er að stökkbreyta má beina Cas9 að hvaða röð sem er í erfðamenginu og klippa þar.^[8]

CRISPR býr því ekki til erfðabreytingu með beinum hætti, heldur veldur aðeins broti í erfðaefninu sem virkja viðgerðarferla frumunnar. Við treystum svo á að fruman geri mistök við DNA-viðgerðina sem síðan leiðir til stökkbreytingar. Þegar brot verður í erfðaefninu fara „viðvörunarbjöllur“ frumunnar í gang og frumuskiptingar eru stöðvaðar þar til viðgerð er lokið.

Misjafnt er hvaða aðferð fruman beitir við viðgerðina. Hægt er að líma saman samliggjandi brotna enda með aðferð sem kallast NHEJ (e. non homologous end joining) og er sú aðferð fljótleg en líklegri til mistaka. Áður en endarnir eru límdir aftur saman þarf gjarnan að snyrta þá til og getur þá orðið úrfelling á nokkrum bösum. Gerist slíkt á mikilvægu svæði innan gens, svo sem í útröð, það er að segja röð sem þýdd er í prótín, getur það leitt til þess að prótínið er ekki myndað og þannig má slá út ákveðnum genum úr erfðamengi fruma og lífvera.

Í mörgum tilvikum er þó markmiðið að koma fyrir nýrri DNA-röð og getur það verið allt frá stakri basabreytingu og upp í heil gen (og meira til). Slíkar breytingar byggja á öðru viðgerðarkerfi frumunnar sem kallast HDR (e. homology directed repair) og er mun nákvæmari viðgerð en NHEJ, vegna þess að þar er notaður samsvarandi DNA-þáttur sem mótíf og gert við þann brotna með nákvæmari hætti. Þegar hagnýta á þetta kerfi er lykillinn sá að sitt hvoru megin við DNA-röðina sem á að innlima séu raðir sem samsvara þeim stað í erfðamenginu sem Cas9 klippir. Tilgangurinn með því er sá að fruman sjái þessar raðir sem samsvara brotnu DNA-röðinni og telji þetta vera samsvarandi þátt sem nota megi sem mótíf við viðgerðina.^[9]

Hagnýting okkar á CRISPR kerfinu felst þar af leiðandi ýmist í því að treysta á að fruman geri mistök við DNA-viðgerðir sem leiðir til eyðileggingar á genum eða á ákveðnu svæði í erfðamenginu, eða blekkja frumuna til að nota okkar erfðabreytta DNA til viðgerða og þannig koma inn nýrri eða breyttri DNA röð.

Samantekt

• Cas-ensím safna sýnum úr grunsamlegu erfðaefni og halda yfir það skrá í erfðamengi sínu.
• Við sýkingu er sýklaskráin umrituð í RNA sem getur beint Cas-ensímum að samsvarandi stað í erfðamengi sýkilsins.
• Cas klippir erfðaefni sýkilsins.
• Með því að hanna álíka RNA-sameind má hagnýta þetta kerfi til að beina Cas að þeim stað í erfðamenginu þar sem markmiðið er að valda stökkbreytingu.

CRISPR-tæknin hrinti af stað byltingu á sviði erfðarannsókna og genalækninga, líkt og áður hefur verið rætt á Vísindavefnum í tengslum við genalækningar og hvítblæði, en hefur einnig haft í för með sér ýmsar siðferðislegar áskoranir.^[10]

Tilvísanir:

1. ^ Nobel Prize Outreach AB, 2020.
2. ^ Hossain, 2021.
3. ^ Han og She, 2017.
4. ^ Ruud, 2002.
5. ^ Hossain, 2021.
6. ^ Han og She, 2017.
7. ^ Gupta, 2019.
8. ^ Nobel Prize Outreach AB, 2020.
9. ^ Xue og Greene, 2021.
10. ^ Arnar Pálsson, 2023.

Heimildir og myndir:

• Nobel Prize Outreach AB. (2020). The Nobel Prize in Chemistry 2020. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020
• Hossain, M. A. (2021). CRISPR-Cas9: a fasscinating journey from bacterial immune system to human gene editing. Progress in molecular biology and translational science, 178, 63-83. https://doi.org/10.1016/bs.pmbts.2021.01.001
• Han, W. og She, Q. (2017). CRISPR history: discovery, characterization, and prosperity. Progress in molecular biology and translational science, 152. https://doi.org/10.1016/bs.pmbts.2017.10.001
• Ruud, J., o.fl. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6). https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x
• Gupta, D., o.fl. (2019). CRISPR-Cas9 system: a new-fangled dawn in gene editing. Life sciences, 232, 116636. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2019.116636
• Xue, C. og Greene, E. C. (2021). DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends in genetics, 37(7), 639-656. https://doi.org/10.1016/j.tig.2021.02.008
• Arnar Pálsson. (2023). Hvað eru genalækningar og er hægt að nota þær gegn hvítblæði? Vísindavefurinn. Hvað eru genalækningar og er hægt að nota þær gegn hvítblæði?
• Yfirlitsmynd: Ernesto del Aguila III, National Human Genome Research Institute, NIH. (2018). CRISPR Cas9. Flickr. https://www.flickr.com/photos/nihgov/41124064215/in/photolist-25DZzxV-FM7sXr-Xz2eVr-D3fstD-Ja54yu-GsAwtj
• Emmanuelle Charpentier and Jennifer Doudna.jpg. (2020, 7. október). Wikimedia Commons. Birt undir CC BY-SA 4.0 leyfi. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Emmanuelle_Charpentier_and_Jennifer_Doudna.jpg
• David Goodsell. (2023, 18. ágúst). Bacteriophage T4 Infection.jpg. Wikimedia Commons. Birt undir CC BY 4.0 leyfi. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bacteriophage_T4_Infection.jpg
• Roxanne Makasdijan og Stephen McNally. (2019). CRISPR illustration gif animation 1.gif. Wikimedia Commons. Birt undir CC BY 2.5 leyfi. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:CRISPR_illustration_gif_animation_1.gif

Aðrar spurningar um CRISPR:

• Hvað getið þið sagt mér um CRISPR? T.d. virkni, uppruni, notkun í líftækni o.fl.
• Hvað er CRISPR-Cas og hvernig er það nýtt til erfðabreytinga?
• Hvernig er ensíminu Cas9 réttan stýrt á réttan stað til að klippa á. Hvernig veit það hvar á að klippa?
• Hvað er CRISPR-Cas og hvernig er það nýtt til erfðabreytinga?

...